【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所傳感技術(shù)國家重點實驗室李昕欣/徐鐵剛團隊在高精度數(shù)字PCR系統(tǒng)研制方面取得重要進展，研制出依賴液相高壓環(huán)境使用PDMS薄膜芯片實現(xiàn)高性能數(shù)字PCR系統(tǒng)。相關(guān)成果以“Overcoming bubble formation in polydimethylsiloxane-made PCR chips: mechanism and elimination with high-pressure liquid seal”為題發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Microsystems & Nanoengineering》上(https://www.nature.com/articles/s41378-024-00725-1)。
該文章被雜志社評選為Featured文章，并在國際學(xué)術(shù)宣傳平臺“Newswise”以“New PCR chip design: high-pressure liquid seal solves bubble problem”為題進行了高度評價。新聞評論說：“這一突破的意義遠遠超出了實驗室的范疇，這項創(chuàng)新能推動具有成本效益的一次性 PCR 芯片的開發(fā)，在臨床醫(yī)療領(lǐng)域可依靠有限資源獲得最先進的診斷結(jié)果。技術(shù)簡單高效，有望加速微流控 PCR 技術(shù)與臨床實踐和研究的結(jié)合，推進精準醫(yī)療的發(fā)展。”(https://www.newswise.com/articles/new-pcr-chip-design-high-pressure-liquid-seal-solves-bubble-problem)。
數(shù)字PCR是近年來迅速崛起的單分子水平的精準基因定量分析技術(shù)。數(shù)字PCR通過微流控芯片技術(shù)同步進行數(shù)萬個等體積的、獨立的PCR反應(yīng)，然后統(tǒng)計陽性反應(yīng)比例，根據(jù)泊松分布原理計算被測樣品中目標分子的絕對數(shù)量。該技術(shù)判定不需要標準曲線，比目前廣泛應(yīng)用的定量PCR產(chǎn)品更加精準可靠，是定量PCR技術(shù)理想的迭代更新產(chǎn)品?，F(xiàn)有的商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)容易出現(xiàn)由氣泡造成的體積誤差，而且需要密封殼和微閥等復(fù)雜結(jié)構(gòu)來防止PCR溶液蒸發(fā)及氣泡擴大，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢、成本高、操作復(fù)雜，致使應(yīng)用仍主要局限于科研領(lǐng)域。
研究團隊闡明了PDMS芯片在PCR過程中產(chǎn)生氣泡的機制，發(fā)現(xiàn)高溫時水的飽和蒸氣壓過高才是引起芯片在PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生氣泡的主要原因，會導(dǎo)致氣泡體積劇增6.4倍，遠遠超過早期研究者曾經(jīng)關(guān)注的0.2倍體積的熱膨脹。氣泡擴增會把PCR溶液擠出反應(yīng)單元，不但毀掉自身反應(yīng)單元還會給其它反應(yīng)單元造成交叉污染。PDMS芯片在熱循環(huán)時伴隨著水的氣化-液化循環(huán)，導(dǎo)致高溫時水蒸氣從反應(yīng)溶液體系中不斷釋放到芯片PDMS材料的納米孔體系中，進一步蒸發(fā)到外部空氣中。低溫時芯片外部的冷空氣通過納米孔介導(dǎo)被不斷吸入到芯片材料內(nèi)，并進入反應(yīng)腔室。二者共同作用形成水蒸氣增強的“呼吸”現(xiàn)象，加速了PCR溶液的蒸發(fā)，導(dǎo)致PCR失敗。
水蒸氣對 PCR 過程中氣泡形成的影響(溫度：25-95 °C，壓力：101.325 kPa)。(a)水的飽和蒸汽壓曲線。(b)熱膨脹僅導(dǎo)致氣體體積略有增加(黑線)，而水蒸氣的平衡效應(yīng)導(dǎo)致等溫膨脹體積大幅度增大(紅線)。(c)PCR 過程中脫氣PDMS 產(chǎn)生的氣泡體積計算值。(d)從水中溶解的空氣溢出后形成的飽和水蒸氣體積。(e)氣泡形成的可能機制，涉及熱膨脹 、PDMS 和 PCR 溶液中空氣的溢出和水蒸氣平衡。
團隊應(yīng)用此理論開發(fā)出基于液相高壓反應(yīng)平臺的無閥非密封PDMS薄膜數(shù)字PCR系統(tǒng)：高溫時，PDMS芯片納米孔內(nèi)部氣體受熱后壓強升高，但是無法突破外部水環(huán)境的高壓；低溫時，水環(huán)境阻止了外部氣體倒吸入PDMS芯片，杜絕氣泡的形成。該系統(tǒng)中，儀器實現(xiàn)高壓液相環(huán)境以阻止氣泡產(chǎn)生和PCR溶液水損失；一次性PDMS芯片實現(xiàn)PCR芯片的樣品填充和數(shù)字化分離。由于不需要密封殼，簡化了PDMS芯片制造工藝，使芯片成本大幅下降；由于即不需要開關(guān)閥門也不需要密封芯片的樣品進出口，簡化了芯片操作，在保持高準確度的前提下提高了檢測速度，實現(xiàn)高效PCR擴增。與市場上現(xiàn)有的數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)優(yōu)勢顯著，具備良好的產(chǎn)業(yè)化前景，有望應(yīng)用于安全防護、疾控中心、重癥監(jiān)護室、門急診、海關(guān)、生物制藥等多個領(lǐng)域。
左上：結(jié)構(gòu)簡單的裸露PDMS芯片及其數(shù)字化結(jié)果；左下：常壓氣相環(huán)境下芯片由于氣泡以及蒸發(fā)導(dǎo)致反應(yīng)失敗；右邊：高壓液相反應(yīng)示意以及PCR反應(yīng)結(jié)果。
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