《柑橘黃龍病菌實時熒光定量PCR檢測技術規程》征求意見

　　【儀表網 行業標準】近日，由全國農業技術推廣服務中心 、華南農業大學 、中國農業科學院柑桔研究所等單位起草，TC271(全國植物檢疫標準化技術委員會)歸口的國家標準計劃《柑橘黃龍病菌實時熒光定量PCR檢測技術規程》征求意見稿已編制完成，現公開征求意見。
 

　　柑橘黃龍病是柑橘生產上最具毀滅性病害，柑橘黃龍病的檢疫檢驗是黃龍病防控的重要組成部分，是阻斷黃龍病傳播的有效途徑和重要手段。為規范柑橘黃龍病檢疫檢驗程序，農業部于2011年制定了《柑桔黃龍病菌實時熒光 PCR 檢測方法》(GB 28062-2011)。距該標準制定已過去11年，隨著柑橘黃龍病菌基因組的測序與公布，在黃龍病菌的PCR檢測上發現了更為特異且靈敏的檢測引物，可進一步優化黃龍病PCR檢測的準確性與靈敏性。因此，有必要對《柑桔黃龍病菌實時熒光PCR檢測方法》進行修訂重新發布。
 

　　本標準包括范圍、規范性引用文件、術語和定義、柑橘黃龍病基本信息、方法原理、實驗室設置、主要儀器設備和試劑、取樣及樣品處理、PCR 擴增、結果判定與表述以及附錄11個部分。
 

　　本次修訂在《柑桔黃龍病菌實時熒光 PCR 檢測方法》(GB 28062-2011)的基礎上進行了調整，主要有以下8個方面。
 

　　1. 全文將“柑桔”修改為“柑橘”。
 

　　2. 在范圍部分，將“柑桔黃龍病亞洲韌皮部桿菌”修改為“柑橘黃龍病病原韌皮部桿菌亞洲種”。修改“黃龍病亞洲韌皮部桿菌”為“韌皮部桿菌亞洲種”。
 

　　3. 在柑橘黃龍病基本信息部分，修改“亞洲韌皮桿菌”為“韌皮部桿菌亞洲種”，修改“非洲韌皮桿菌”為“韌皮部桿菌非洲種”，修改“美洲韌皮桿菌”為“韌皮部桿菌美洲種”。
 

　　4. 在取樣方法部分。對葉片樣品的采集根據癥狀進行區分采樣，修改為“疑似病樹優先采集疑似斑駁黃化癥狀的葉片，如無典型癥狀，按樹冠東南西北四方采集，每點取上中下部葉片各1片，每棵樹共采集葉片12張。”果實樣品中增加“橘絡”組織樣本。便于植物檢疫人員能更準確地采集疑似黃龍病相關的樣品，從而提高檢測的有效性。
 

　　5. 在結果判定與表述部分。在質控標準中，陽性對照的 Ct值從“應<28.0”修改為“應≤30.0”。對特殊情況樣本的判斷中建議“用在基因組中有 5 個拷貝的核苷酸還原酶基因引物進行實時熒光 PCR 復測”，以進一步提高檢測的準確性。
 

　　6. 在附錄 D 柑桔黃龍病的癥狀鑒定部分，替換了部分黃龍病的癥狀圖片，刪除柑橘木虱模型圖替換為實物圖，同時補充對柑橘木虱的詳細描述，以便于植物檢疫人員能更準確地采集黃龍病及柑橘木虱相關樣品。
 

　　7. 在附錄 F 檢測試劑配制及實時熒光 PCR 檢測部分，將韌皮部桿菌亞洲種的熒光染料法檢測引物 CQULasF03/CQULasR03 替 換 成 特 異 性 更 高 的 HLBas-G/CLas-4G ( 5 ' TCGAGCGCGTATGCGAATACG-3'/5'AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3')并增加熒光標記探針 HLBp(序列為 5 '-AGACGGGTGAGTAACGCG-3')，以進一步提高韌皮部桿菌亞洲種檢測的特異性。
 

　　8. 增加附錄 G 部分，增加靶標韌皮部桿菌亞洲種核苷酸還原酶β基因(nrdB 基因)的實時熒光PCR檢測，以用于復測基于16S rRNA 基因引物 HLBas-G/CLas-4G 檢測時 Ct 值大于35但小于40的樣品。
 

　　本文件規定了柑橘黃龍病病原韌皮部桿菌亞洲種(Candidatus Liberibacter asiaticus)實時熒光PCR檢測的樣品制備、檢測操作方法和結果判定標準。
 

　　本文件適用于對蕓香科和非蕓香科罹病植株和傳病媒介柑橘木虱中韌皮部桿菌亞洲種的檢測和病害鑒定。
 

　　更多詳情請見附件。